01/产品概述

Easyclone技术代表了一种创新的DNA无缝克隆方法，它以简洁、迅速且高效的手段实现特定DNA片段的精确克隆。该技术通过将载体线性化，并在插入片段的正向和反向PCR引物的5'端引入与线性化载体末端相匹配的序列（15-20bp），确保PCR产物的两端能够与线性化载体的相应末端完美对接。在这种条件下，PCR产物与线性化载体按照特定的比例混合，并在重组酶的作用下，在37℃下仅需5分钟的反应时间，即可实现1-5个片段高效转化和定向克隆。

新一代的2x Easyclone混合试剂盒采用了独特的非连接酶依赖体系，这一创新显著减少了载体自连的发生率，从而将阳性克隆率提升至95%以上。仅需5分钟的反应时间即可完成重组过程，极大地简化了实验操作，提高了实验的便捷性和效率。Easyclone技术为科研人员提供了一种快速且可靠的克隆解决方案。

02/产品组分

03/保存条件

收到货后-80°冻存（可放置3年，活性不会降低）。

使用时，取出一管-30 ~ -15℃保存（6个月）。

04/特点

a.      简单，快速

b.      无需考虑酶切位点，任何片段可克隆到任何目的载体的任何位置

c.      克隆阳性率在95%以上，降低后续克隆筛选的工作量

d.      可同时进行最多5个DNA片段的组装

05/适用范围

 ◇ 快速克隆 ◇ 高通量克隆 ◇ 无缝克隆 ◇ DNA定点突变

06/使用说明

1.反应体系

 冰上配制如下反应体系：

 2xEasyclone mix                              5 μL

线性化克隆载体                               A ng

插入片度（PCR 扩增产物 ）         B ng

ddH₂O                                          up to  10μL

2x Easyclone mix重组反应体系最适 DNA 使用量为每线性化片段 0.03pmol。

该摩尔数对应的 DNA 质量可 由以下公式计算获得：

片段添加量（ng）= 0.02×片段碱基对数（bp）（对应的片段浓度为 0.03 pmol）

2、重组反应

37℃ 恒温反应 5min后置于冰上孵育。

3、转化 :

(1)取化学转化感受态细胞于冰上解冻。

(2)取上述反应液 10 μL 加入到感受态细胞中充分混匀。冰浴 10min。

(3)将离心管置于 42℃水浴锅中热激 1min，然后迅速放回冰上，使细胞冷却 2～3min。

(4)向离心管中加入已预热的无菌 LB(或 SOC)培养液 600μL，37℃恒温振荡培养～30min。 (5)涂布至载体对应抗性的平板上，37℃过夜培养。

4. 阳性克隆的鉴定

（1） 菌落/菌液 PCR 鉴定：用枪头挑取单菌落至 10 μL 无菌水中混匀后取 1 μL 为模板，或直接蘸取菌落至 PCR 体系中扩增（建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果）；

（2）以质粒为模板 PCR 鉴定：挑取单克隆至含相应抗生素的 LB 培养基中，37℃，200 rpm 过夜摇菌后抽提质粒作为模板，可使用载体通用引物或特异性引物扩增；

（3） 酶切鉴定（若有需要）：挑取单克隆至含相应抗生素的 LB 培养基中，37℃，200rpm 过夜摇菌后

抽提质粒，使用相应内切酶酶切质粒后电泳检测片段大小；

（4） 测序：建议使用载体通用引物测序鉴定。

规格参数

50rxn/100rxn

包装

袋